【Nature子刊】分工明确！前额叶皮层介导吗啡成瘾的分子、环路机制

最新统计数据显示，截至2018年底，中国在册吸毒人员240.4万名，同比下降5.8%。其中，滥用冰毒人员135万名，占56.1%；滥用海洛因88.9万名，占37%；滥用氯胺酮6.3万名，占2.6%。尽管我国治理毒品滥用取得一定成效，但合成毒品滥用仍呈蔓延之势，滥用毒品种类和结构发生新变化。

——《2018年中国毒品形势报告》 

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普遍认为，实际吸毒人数是在册吸毒人数的5倍以上，那么我国可能有超过1200万人为毒品的受害者，因此毒品滥用正逐渐成为严重的医学问题与社会学问题。

若要解决这方面的问题，加强监管力度必不可少，但探究毒品成瘾的神经学机制同样不可或缺。正所谓知己知彼，百战不殆，运筹帷幄，克敌机先。 

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然而，克敌机先并非易事。毒品种类纷繁多样，其作用机制也是大不相同。在本篇文章中，我们专门针对阿片类物质的成瘾机制。阿片类毒品一直广为流行，成瘾者遍及全世界，其代表性分子便是海洛因和吗啡。临床医学中，吗啡是一种常用镇痛剂，镇痛效果极佳，但具有成瘾性。吗啡成瘾的分子、环路机制，一直是神经科学研究热点之一。

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大量研究指出，内侧前额叶皮层亚区前边缘皮层（Prelimbic cortex, PrL）参与药物成瘾过程[1-4]，而皮层编码各类功能依赖于各类神经元之间的环路连接。皮层中有投射神经元与中间神经元，投射神经元负责支配下游脑区，为兴奋性神经元；中间神经元负责各类信息的编码、整合，负责调节投射神经元的活性，为抑制性神经元[5]。

中间神经元对投射神经元的调控

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在啮齿类动物与人类的皮层中，中间神经元对投射神经元产生抑制性投射[6]，各类中间神经元之间也会产生投射[7,8]。表达生长激素抑制素（SST）和小清蛋白（PV）的神经元是PrL中两大类中间神经元，很多神经疾病与之相关。在精神分裂症模型鼠中，PV中间神经元功能紊乱[9]；AD模型鼠中，SST中间神经元功能异常[10]。然而，吗啡等阿片类药物如何作用于PrL各类神经元以产生成瘾性，我们知之甚少。

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2019年8月14日，《Nature》子刊《Molecular Psychiatry》杂志在线刊登了复旦大学脑科学研究院马兰教授和基础医学院王菲菲教授共同合作的最新重要工作[11]，他们发现吗啡区别性作用于PrL中两类不同中间神经元，引起多基因转录水平、电生理功能性投射发生变化，最终导致成瘾性与敏化的产生。该研究揭示了PrL中间神经元介导吗啡成瘾性的分子、环路机制，极大提高了人们在药物成瘾领域中的认知。

马兰教授

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结果

1.PrL中PV而非SST神经元介导吗啡的去抑制作用

     首先，为探究吗啡诱导PrL锥体神经元的去抑制作用由哪种中间神经元介导，作者在PV-Cre或SST-Cre小鼠的PrL中注射AAV-DIO-ChR2，膜片钳记录锥体神经元，通过LED光激活PV、SST神经元，发现PV-锥体神经元与SST-锥体神经元投射的连接率相仿（图1a-d）。接着，他们在小鼠腹腔中注射吗啡，发现吗啡处理后光激活PV神经元在锥体神经元中诱发的抑制性突触后电流（IPSC）幅度显著减小，而光激活SST神经元诱发的IPSC幅度不变（图1e-h）。

接着，为证实中间神经元中μ型阿片类受体（MOR）参与上述去抑制现象，作者在PV-Cre或SST-Cre小鼠的PrL中混合注射AAV-DIO-ChR2与AAV-Flex-MOR-shRNA，由此小鼠PrL PV或SST中间神经元中会表达ChR2而不表达MOR（图1a）。他们发现，沉默PV神经元中MOR后，光激活PV神经元诱发锥体神经元产生的IPSC不再受吗啡处理影响，光激活SST神经元诱发的IPSC亦无变化（图1e-h）。

以上结果表明，PrL中PV与SST中间神经元均对锥体神经元产生大量抑制性投射，其中PV神经元的抑制性投射受吗啡调控，SST神经元的抑制性投射不受吗啡影响。

图1 PrL中PV而非SST神经元介导吗啡的去抑制作用

2.吗啡增加PrL中PV中间神经元的抑制性输入

过去研究表明，成瘾物药物可以改变mPFC神经元的电生理活性[12]。为探究吗啡在此方面的作用，作者全细胞记录PrL中PV、SST中间神经元的微小型IPSC（mIPSC），发现在吗啡作用下，PV神经元中mIPSC幅度和频率均显著增加，而SST神经元不受影响（图2i-n）。此外，注入去极化电流时，吗啡处理减少PV神经元的发放频率，增加SST神经元的发放频率（图2o-r），表明吗啡增加PrL中PV中间神经元的抑制性输入，进而降低PV神经元的活性。

至此，很多小伙伴很可能会认为吗啡的作用靶点是PV中间神经元。然而，事实果真如此吗？

图2 吗啡增加PrL中PV中间神经元的抑制性输入

3.吗啡增加PrL中SST-PV中间神经元的抑制性输入

大量证据指出，多种中间神经元之间的相互作用参与皮层去抑制微环路[13-16]，由此作者探究吗啡对SST-PV投射的影响。他们引入LhX6-EGFP转基因小鼠，其中大多数起源于内侧神经节隆起的中间神经元会表达GFP[17]，然后将这种小鼠与SST-tdTamato小鼠交配，其子代皮层中SST中间神经元同时发出红色荧光与绿色荧光，其它类型中间神经元只发出绿色荧光，其中PV中间神经元占比56.62%（图3a-b）。

然后，他们在LhX6-EGFP/SST-Cre小鼠的PrL中注射AAV-DIO-ChR2，电生理记录PrL PV神经元（通过快速放电性质判断）的IPSC，发现吗啡处理后，SST-PV投射的连接率不变，光激活诱发的IPSC幅度增加，波形波宽不变（图3c-h）。此外，吗啡显著降低配对脉冲比（Paired-pulse ratio, PPR），而不影响IPSC的变异系数（图3i-k）。以上结果表明，吗啡增加PrL SST中间神经元到PV中间神经元的抑制性输入，且突触前机制参与此过程。

图3 吗啡增加PrL中SST-PV中间神经元的抑制性输入

4.吗啡特异性作用于SST中间神经元的分子机制

上文已知，吗啡对SST、PV中间神经元的作用大不相同，于是接下来作者探究其中的分子机制。他们将SST-Cre或PV-Cre小鼠与RPL22-HA报告鼠杂交，以在小鼠SST或PV中间神经元中特异性表达HA-tag标记的核糖体蛋白（图4a）。吗啡作用12小时后，他们分选出小鼠PrL中与核糖体有关的转录物并测序，发现SST中间神经元转录物的变化更多，有1558个基因；PV中间神经元只有328个基因的转录水平产生变化（图4b-c）。

然后，为推测神经元中受吗啡影响的分子通路，作者使用ClueGO在两种抑制性中间神经元中重建调控网络，并发现Rac1是SST中间神经元中吗啡调节信号网络的核心（图4d）。Rac1是Rho家族GTP酶的一员，负责调节肌动蛋白细胞骨架与结构可塑性[18-20]。qRT-PCR结果亦有收获，他们发现吗啡处理后，小鼠PrL SST神经元而非PV神经元中Arhgef6的表达量也显著上调，原位杂交方法进一步证实此结论（图4e-f）。

过去的研究表明，吗啡长时间作用于MOR可引起神经元中δ型阿片类受体（DOR）从胞内转移至神经元表面[21]。为探究MOR与DOR是否参与吗啡诱导Rac1、Arhgef6转录水平上调这一过程，作者在SST-Cre小鼠的PrL中注射AAV-Flex-DOR-shRNA或AAV-Flex-MOR-shRNA以沉默PrL SST神经元中DOR或MOR，发现沉默DOR的小鼠在吗啡作用下Rac1、Arhgef6转录水平显著下调，而沉默MOR的小鼠无此影响（图4g-h），表明吗啡通过与DOR的作用上调PrL SST中间神经元中Rac1与Arhgef6的转录水平。

图4 吗啡特异性上调PrL SST中间神经元中Rac1信号通路

5.DOR与Rac1介导吗啡对PV-SST抑制性投射的强化

为进一步探究吗啡强化PrL PV中间神经元的抑制性输入是否依赖于DOR与Rac1，作者在LhX6-EGFP/SST-Cre小鼠的PrL注射AAV-DIO-ChR2与AAV-Flex-DOR-shRNA并对小鼠进行吗啡处理，膜片钳记录PV神经元，发现沉默DOR后，光激活SST神经元引起PV神经元产生的IPSC幅度减小，连接率不变（图5a-d）。而光激活SST神经元引起锥体神经元产生的IPSC幅度和连接率均不变（图5e-h）。

接着，作者在LhX6-EGFP/SST-Cre小鼠的PrL注射AAV-DIO-ChR2与AAV-DIO-Rac1-DN（Rac1-DN为Rac1的显性失活突变体）并对小鼠进行吗啡处理，膜片钳记录PV神经元，发现失活Rac1后，光激活SST神经元引起PV神经元产生的IPSC幅度减小，连接率不变（图5i-l）, 光激活SST神经元引起锥体神经元产生的IPSC幅度不变，连接率降低（图5m-p）。此外，SST中间神经元附近的锥体神经元被吗啡去抑制，表征为去极化电流引起神经元发放的频率增加，而失活Rac1后此效应不复存在（图5q-r）。

以上结果表明，吗啡通过DOR和Rac1信号通路强化PV-SST抑制性投射，并可能由此弱化PV-锥体神经元抑制性投射。

图5 DOR与Rac1介导吗啡对PV-SST抑制性投射的强化

6.PrL不同通路介导吗啡成瘾性与敏化作用

     最后，是行为学功能的探究。过去的研究表明，PFC参与吗啡成瘾性的产生与敏化作用[22]。为探究PrL两类中间神经元中DOR、MOR在此过程中的作用，作者在SST-Cre或PV-Cre的PrL中注射AAV-Flex-MOR-shRNA或AAV-Flex-DOR-shRNA，发现PrL SST神经元中沉默DOR抑制吗啡诱导的条件位置偏好与运动能力提升，沉默MOR无此效应（图6a-c）。接着，他们在SST-Cre或PV-Cre的PrL中注射AAV-DIO-Rac1-DN，发现PrL SST神经元中失活Rac1抑制吗啡诱导的条件位置偏好与运动能力提升（图6d-f）。此外，PrL PV神经元中沉默MOR不影响吗啡诱导的条件位置偏好，但降低了小鼠的运动能力（图6g-i）。

综上，PrL SST中间神经元中DOR-Rac1通路在吗啡诱导成瘾性与敏化过程中是必要的，PV神经元中MOR也参与吗啡诱导敏化过程。

图6 PrL不同通路介导吗啡成瘾性与敏化作用

总结
毒品滥用是目前我国严重的医学问题与社会学问题，形势十分严峻。解决这一问题，不能仅凭借监管，还需科研界解析毒品的成瘾机制。过去研究表明，前额叶皮层中PrL亚区参与药物成瘾，但究其分子、环路机制，我们尚未可知。本篇文章以吗啡作为研究对象，结合膜片钳电生理、基因沉默、光遗传学、行为学等方法，发现吗啡通过DOR-Rac1通路强化SST中间神经元对PV神经元的抑制性投射，从而去抑制投射神经元，进而诱发成瘾性与敏化效应（图7）。这项研究阐释了阿片类物质诱发皮层功能紊乱的分子、环路机制，为临床解决阿片类药物成瘾相关问题提供大力支持！

图7 SST、PV中间神经元介导吗啡成瘾神经学机制示意图

复旦大学马兰研究组通过膜片钳电生理、基因沉默、光遗传学、行为学等技术手段阐释介导吗啡成瘾的分子、环路机制。和元上海有幸提供实验中使用的AAV病毒（见下图），用实际行动助力中国脑科学的发展。OBiO 和元上海
1

AAV-CMV-Flex-MIR30shRNA-EGFP

2

AAV2/9-EF1α-DIO-Rac1-DN-mcherry

3

AAV2/9-Flex-MOR-shRNA-EGFP

4

AAV2/9-Flex-DOR-shRNA-EGFP

5

AAV2/9-Flex-Scramble-shRNA-EGFP

OBiO

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参考文献

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